成人呼吸道感染病原诊断核酸检验测试技术临床应用专家共识(2023)

  

  不同检测技术所提供的结果具有不一样临床意义，联合应用可进一步提升病原学检测的灵敏度和特异度， 更好的解释患者的病程发展并进行及时有效的治疗监测。

  2023年8月，由中国医学科学院北京协和医院检验科徐英春教授、上海交通大学附属瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授为通信作者发布了《成人呼吸道感染病原诊断核酸检验测试技术临床应用专家共识（2023）》。

  共识专家组由中华检验医学培训工程专家委员会和中华医学会呼吸病学分会委员推荐产生。2021年12月召开共识启动会，就共识关键性问题拟定提纲及任务分工，组建共识执笔组、撰写专家组、评审专家组。共识执笔组以“呼吸道感染（respiratory tract infection）”“分子检测（molecular testing）”“分子诊断技术（molecular diagnostic tests）”为关键词，检索PubMed 、中国知网、万方数据知识服务平台和维普数据库中的中、英文文献，经去重及阅读文献摘要和/或全文，共纳入55篇文献，形成共识。

  分子诊断技术在呼吸道感染性疾病，尤其是全球应对新冠病毒大流行中，发挥了及其重要的作用，高灵敏度和高特异度的核酸扩增试验（nucleic acid amplification tests ，NAATs）已成为诊断新冠病毒感染的参考标准。随着基因组学、工程学和纳米科学等前沿学科的交叉融合加快速度进行发展，NAATs呈现出多种多样的检测的新方法和日新月异的技术方法，以 PCR为基础发展出的实时荧光PCR、多重PCR、数字PCR和等温扩增技术，以及高通量测序、基因芯片、核酸质谱、生物传感器等检测技术，在大型实验室批量检测或现场核酸即时检测（point-of-care testing, POCT）中得以广泛应用。除呼吸道病毒外，一些系统还能检测细菌性肺炎的常见病原体及特定耐药基因。面对诸多检测的新方法，临床医生和微生物实验室需审慎判断何时选择何种方法或不同方法的组合，其决定因素包括流行病学、实验室资源、工作流程和检测成本等（表2）。

  实时荧光PCR技术是一种可对核酸进行定量的试验方法，其原理主要是通过实时采集荧光信号对核酸扩增进行监测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值与其起始拷贝数存在线性关系，可实现对未知样本的定量检测。

  要适用于门急诊、住院患者和大人群筛查，基于分子检验平台做病原体（包括病毒、细菌、真菌、非典型病原体）的核酸检验测试，检测标本类型以鼻咽拭子、痰和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）为主。现有的商品化单靶标核酸检验测试病原体包括：新冠病毒、鼻病毒、嗜肺军团菌、耶氏肺孢子菌等；多靶标核酸检验测试病原体包括：呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌等。

  作为传统的经典定量分析方法，荧光探针法的灵敏度和特异度明显优于底物发光法，但特异性引物探针的成本和对仪器的要求比较高。其结果判读较为复杂，需要对扩增曲线 性能验证要求

  定量检测需验证的性能指标包括：正确度、精密度（包括测量重复性和测量中间精密度）、不确定度、特异度（包括抗干扰能力）、灵敏度、检出限、定量限、线性区间（可报告区间）等。定性检测需验证的性能指标包括：方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等，具体性能指标以产品说明书要求为准。

  相较传统 PCR 变温技术，等温扩增技术通常不需要改变反应温度，该技术方案多、技术原理差异较大，且各具优势，但基础原理仍是以特异性酶和引物进行扩增。等温扩增技术大多为指数扩增，目前多为定性检测。

  主要适用于发热门诊、急诊患者上呼吸道感染病毒（如新冠病毒、流感病毒等）及下呼吸道感染细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）的快速筛查。

  等温扩增反应通常耗时短，扩增效率高，不需要 PCR 循环仪且简单易操作，但由于其技术的复杂性，尚难以全部直接用于临床。

  通常等温扩增为定性实验，需满足中国合格评定国家认可委员会GL039定性实验的验证要求：符合率≥90%；阴性和弱阳性样本精密度检测结果完全一致；参照厂家说明进行靶基因检测，5次重复检测应 100%检出，20次重复检测应检出至少18次。

  数字PCR是一种不依赖于核酸外标的核酸绝对定量技术。其原理是通过微流控技术，将目标核酸和PCR 反应液分布在多个反应单元内进行PCR 扩增，以液滴形式进行仔细的检测的方式也被称为微滴数字PCR。该技术通过检验测试扩增后每个反应单元的荧光信号强度，判断含有目标核酸的反应单元个数，基于泊松分布计算起始样本中的目标核酸分子数，实现对核酸浓度的绝对定量。

  可直接定量检测样本中病原体个数，非常适合于低浓度样本、低丰度基因或突变基因的检测，也可作为质控方法评估其他分子检验测试产品的扩增效率。

  无需标准曲线和标准品，可大大降低临床样本复杂本底对扩增的干扰， 拥有非常良好的重现性和准确度。其主要影响因素是PCR扩增和荧光信号分析，前者与PCR扩增效率、扩增体系的配置有关；后者与检测器的灵敏度、核酸拷贝数、被分割成的物理单元数以及反应单元数有关，反应单元数越多，灵敏度越高。

  应使用泊松分布计算靶标分子拷贝数，不同荧光通道之间应不存在相互干扰。定量检测性能指标应包括：反应单元体积精密度、准确度、有效率；样本检测重复性、线性、动态范围、灵敏度。基于芯片的数字PCR芯片内应无气泡，阳性和阴性的随机分布应得到视觉确认。微滴数字PCR单次反应生成的最小液滴数应符合厂商建议或用户自定义值。

  核酸即时检测为POCT技术中涉及核算检验测试的一大类技术的总称，是核酸提取技术和分子扩增技术（包括实时荧光PCR 、巢式 PCR、等温扩增、数字PCR等技术）的融和。其最大特点是将核酸的提取、扩增、检测均置于一个反应装置中，通过特定设备对扩增信号检测，完成对靶标核酸的筛查。目前核酸POCT主要以全自动封闭管理系统为主。

  主要适用于发热门诊、急诊、ICU和某些特定病区感染患者的病原体快速检测。与传统POCT不同，呼吸道病原体核酸POCT需要对检测病原的生物安全做评估。流感病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌等呼吸道病原体核酸 POCT 产品，已作为该类型代表产品问世。

  核酸POCT的灵敏度和特异度高于免疫学POCT，但其成本比较高。虽然大部分核酸POCT产品为封闭体系，但仍需注意 PCR 污染的可能性。此外，其检测设备一般较小，便于携带，但也导致其通量较低，不适用于大人群筛查，满足大型医院临床检测需求往往需要配备多组设备。

  定性检测性能验证指标至少包括：符合率≥90% ；阴性和弱阳性样本精密度检测结果完全一致；靶基因5次重复检测应100%检出，20次检测应至少检出18次。定量检测性能验证指标至少包括：至少80%的样本结果偏倚在±7.5%区间内；批内和批间精密度满足说明书范围；线性区间满足说明书范围；20次检测中≥18个检测结果与参考值之间的偏倚在±7.5%区间内。

  病原体高通量测序技术是采用高通量测序技术对临床标本中的核酸进行测序，通过与微生物参考基因组比对获取标本中的微生物物种组成、物种丰度等信息。目前该技术大致上可以分为三类：无偏倚检测的 mNGS、检测多重病原体及其耐药基因或毒力基因的tNGS 和获取某一种或多种病原体全基因组数据的高通量测序技术（whole-genome sequencing ，WGS）。

  由于病原体高通量测序技术复杂、结果解读难度大且价格昂贵，建议根据临床需求在传统微生物检测的基础上选择性使用，例如，需尽快明确病原学诊断时、目前可及的微生物检验手段无法明确诊断时、出现聚集性呼吸道传染性病例需进行病原体溯源时。

  病原体高通量测序技术可对标本中的核酸片段进行物种鉴定，但其物种、耐药基因和毒力基因鉴定的准确性受标本采样、实验操作流程、病原体参考基因组数据库和生物信息学分析等多种因素影响。在临床报告的解读过程中，除深入分析测序数据外，结合患者临床信息及其他实验室数据综合判断和鉴别定植菌与责任病原体亦十分关键。

  实验室在开展病原体高通量测序临床检测前，需参考实验室自建方法的有关要求完成方法学建立和性能确认，结合预期临床用途确立预期性能指标，包括：

  急性上呼吸道感染是由各种病毒和/或细菌引起的，主要侵犯鼻、咽或喉部的一组急性感染性疾病，以病毒感染多见，如鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠状病毒等，少数为细菌感染，以链球菌常见。临床症状不具有特异性，多以上呼吸道卡他症状、咽部不适为临床表现，可伴发热、头痛、咳嗽等其他症状。

  需根据疾病流行情况、患者病情严重程度、症状维持的时间、合并症情况、免疫抑制状态评估结果、其他辅助检查结果的可参考性以及对预后的初步评判， 决定是不是对疑似急性上呼吸道感染的上述患者进行检测。

  在流行风险高的季节，高危人群（老年人、儿童、孕产妇、合并基础疾病患者）进行流感病毒检验测试可能比经验性抗流感治疗更经济。此外，快速的结果反馈（如2h内即出结果的快速分子检测）能够缩短患者门急诊就诊时间，降低流感传播风险，有利于传染病控制。

  气管支气管炎指气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，常因病毒或细菌感染从而引起该疾病加重。主要体现为长期咳嗽咳痰，伴/不伴呼吸困难等表现。该病临床特征特异性不强，常需与慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张症等疾病鉴别，此时需结合肺功能、胸部CT等检查协助诊断。

  对于反复急性加重、发热伴有脓痰、病情评估需要住院诊治的患者， 可考虑细菌涂片或培养尽快明确病原学以指导抗生素应用。

  我国成人社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）常见病原体为肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等 ，近年研究显示，病毒性肺炎在成人CAP 中占比高达15.0%~34.9%，同一患者可同时合并细菌、病毒、真菌等病原体感染。

  重症CAP接受机械通气治疗的患者，若经验性治疗无效，怀疑有特殊病原体感染，或经积极抗感染治疗病情无好转，需与非感染性肺部病变鉴别，可经支气管镜留取下呼吸道标本进行病原学检测。肺炎合并胸腔积液，尤其是肺炎病灶同侧的胸腔积液可行胸穿进行胸水病原体检测。

  CAP的致病菌培养往往耗时长，而苛养菌感染培养阳性率较低，因此核算检验测试在诊断CAP病原学方面具有较大优势。若怀疑为支原体、衣原体、军团菌、病毒等感染时，可采用血清特异性抗原、抗体检测联合核算检验测试和分离培养；实时荧光 PCR、等温扩增、数字PCR、高通量测序技术可同时检测多种病原体，提供病原体分型、毒力基因和耐药基因等深入分析，如果临床倾向于RNA病毒感染，建议选择RNA高通量测序。

  医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia, HAP）/呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia, VAP）是我国常见的医院获得性感染。发生 HAP/VAP 后平均住院时间、抗感染治疗疗程均延长，且住院医疗费用增加。我国 HAP/VAP常见病原菌包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等，耐药菌较为常见。

  临床诊断HAP/VAP 后，应积极留取呼吸道、血液、胸腔积液标本行微生物学检查。呼吸道标本应尽可能先进行涂片镜检，再做病原体培养、抗原及核酸检验测试等。

  (2) HAP/VAP患者应通过非侵入性方法还是侵入性方法获得呼吸道标本？

  非侵入性方法指经咳痰、鼻咽拭子、鼻咽吸取物或气管导管内吸引收集标本。侵入性方法指经支气管镜留取下呼吸道标本、经支气管镜或经皮肺穿刺活检留取组织标本等。对于 HAP 患者，应先通过非侵入性方法留取呼吸道分泌物涂片及半定量培养，经验性治疗无效、疑似特殊病原菌感染或采用非侵入性方法获 得的呼吸道标本无法明确病原体时，再通过侵入性方法采集标本行微生物学检查。

  HAP/VAP患者常见病原体为细菌，病原学诊断以传统培养为主，必要时可联合多重PCR、微流控芯片等多靶标病原体核算检验测试，无需常规进行mNGS 。仅在患者存在免疫缺陷、3d内未通过传统微生物学检测获得明确病原学依据，且经验性抗感染治疗无效时，考虑进行以DNA检测为主的mNGS。

  慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease ，AECOPD）是慢阻肺病程中的常见和重要事件，通常被描述为有慢性阻塞性肺疾病基础的患者出现呼吸道症状的急性恶化而导致额外治疗。其主要症状是气促加重，常伴有咳嗽加剧、痰液分泌增加和/或痰液性状改变，部分患者可伴有心悸、疲乏等不适，严重者可出现呼吸衰竭和/或心功能不全的临床表现。

  这些症状均缺乏特异性，因此需与其他肺内疾病（如肺炎、肺栓 塞、气胸等）和肺外疾病（如心源性肺水肿、心律失常等）鉴别。下呼吸道细菌感染是AECOPD的常见原因，常见致病菌包括流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌目细菌；相对少见的病原体包括肺炎衣原体、肺炎支原体、军团菌、金黄色葡萄球菌等，鼻病毒等呼吸道病毒也是AECOPD的常见诱因。

  3.4.2 是否推荐AECOPD患者常规进行流感病毒、新冠病毒抗原和/或核酸检测？

  肺是结核分枝杆菌进入人体的主要通道，结核分枝杆菌通过吸入引起肺部感染。肺结核往往发展缓慢，临床表现多样。肺结核的诊断并不简单，常规实验室检查对其诊断帮助有限，胸部影像学具有关键价值， 胸部CT比X线能提供更多有价值的细节。肺结核的确诊依靠细菌学检查，抗酸染色对结核分枝杆菌的诊断很重要，但缺乏特异性，其他非结核分枝杆菌也可呈阳性；分枝杆菌培养是确诊方法。

  对无法获取合格痰标本的患者，气管镜检查获取BALF和防污染毛刷标本尤其重要。

  核酸扩增技术可作为结核分枝杆菌快速诊断方法。美国疾病预防控制中心建议对可疑活动性结核的涂片抗酸染色阴性患者，至少进行一次呼吸道标本的结核分枝杆菌核酸检验测试。对涂片抗酸染色阳性患者，核酸扩增技术则可帮助鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

  对涂片阴性、培养阳性的结核患者，痰标本结核分枝杆菌核算检验测试的灵敏度和特异度分别为68%和96%。因此，一次核酸检验测试阴性结果不足以排除肺结核的诊断。

  实际工作中仍有16%的病例，在缺少病原学结果的情况下临床诊断肺结核并接受诊断性抗结核治疗。

  胸腔积液也是一种结核分枝杆菌感染的表现。结核性胸腔积液通常为渗出液并以淋巴细胞为主。胸水抗酸染色通常阴性，胸水结核分枝杆菌培养阳性率可达50%左右 ，胸水的结核分枝杆菌核酸检验测试具有高特异度和低灵敏度。强烈推荐怀疑结核性胸膜炎的患者接受胸膜活检和胸水分枝杆菌培养。胸膜活检标本病理检查和分枝杆菌培养联合诊断率可达80% 。50%~97%的病例胸膜活检显示为肉芽肿， 40%~80%的病例分枝杆菌培养阳性。

  3.5.7 如何明智的选择结核特异性PCR或tNGS/mNGS进行结核分枝杆菌检测？

  结核特异性PCR与tNGS/mNGS对结核分枝杆菌的诊断能力相似。与传统方法相比，tNGS/mNGS 比结核特异性PCR联合检测更具优势，能显著改善结核和其他病原体的病原学诊断，tNGS检测可提供结核耐药基因的支持。

  免疫功能受损包括原发和继发的免疫功能受损，比如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV）感染属于原发性免疫功能受损，肿瘤、 干细胞及实体和自身免疫性疾病经常使用糖皮质激素、免疫抑制剂等属于继发免疫功能受损。除常见病原体外，结核分枝杆菌、诺卡氏菌、巨细胞病毒、 耶氏肺孢子菌、曲霉和隐球菌等机会性感染的几率更高，机会性病原体感染后症状与体征隐匿，尤其HIV感染、患者发生下呼吸道感染时病原学构成更为复杂，条件致病菌、少见病原体、混合感染发生的比例更高，此时患者病情更重、进展更迅速。可考虑多种方法并行送检，临床常需积极开展涵盖目标病原体的多靶标核酸检验测试或mNGS以尽早诊断致病病原体。

  在经验治疗的同时，应尽早开展支气管镜检查及支气管肺泡灌洗进行包括PCR或mNGS等在内的病原体检测，减少初始经验性治疗对病原学检测结果的影响。对BALF样本做的其他微生物检查项目取决于患者临床表现、影像学特征以及特定病原体感染的危险因素，进行包括细菌涂片和培养、真菌涂片和培养、细胞学分析、组织病理学等在内的病原学检查。

  对侵袭性真菌感染的高危患者，建议行真菌荧光染色、真菌培养、血清学、分子生物学甚至组织病理学检测。尤其线- β-D-葡聚糖（G试验）、隐球菌荚膜多糖抗原、血及 BALF标本曲霉半乳甘露聚糖（GM试验）联合核算检验测试，可提高真菌检出率；对于能够得到组织病理学标本的患者也可行mNGS；如临床倾向肺孢子菌感染，可采用呼吸道标本六胺银染色或PCR，联合血清G试验，以明确判断，BALF及血标本mNGS也有助于诊断，但PCR或mNGS肺孢子菌阳性不能区分定植和感染，需要结合临床综合判断。

  3.6.3 对免疫受损宿主合并肺部感染宿主，有必要开展血标本mNGS吗？

  免疫受损宿主肺部感染伴发菌血症的机会为5%~10%，明显高于免疫功能健全宿主，此类患者出现重症CAP时，可一起进行BALF及血标本mNGS ，以协助明确可能的致病菌；血标本mNGS检测特异度略高于BALF ，灵敏度低于BALF。

  PCR技术具有较高的灵敏度及特异度，对发展成有症状感染的诊断也有很 高的阴性符合率， 已成为检测病毒感染的标准方法。尤其推荐在造血干细胞及实 体后定期采用PCR办法来进行病毒（包括巨细胞病毒、EB 病毒和其他季节性流行呼吸道病毒）的动态检测。

  成人呼吸道感染类型多样，不同感染类型及不同基础疾病患者病原谱各具特点，在临床常规诊疗过程中，应以患者临床症状体征为基础，联合应用影学、传统微生物学、免疫学和分子生物学等检测技术（表3），依据相应检验测试标准作出快速、精准诊断。分子生物学诊断技术在临床的应用目前仍有较多问题亟待解决，尤其是对临床结果的正确解读。不同检测技术所提供的结果具有不一样临床意义，联合应用可进一步提升病原学检测的灵敏度和特异度， 更好的解释患者的病程发展并进行及时有效的治疗监测。