科研 西北农大： 微生物组学和代谢组学综合分析揭示了半干旱农场土壤微生物和代谢功能对磷肥的响应(国人佳作)

  

  科研 西北农大: 微生物组学和代谢组学综合分析揭示了半干旱农场土壤微生物和代谢功能对磷肥的响应(国人佳作)

  本研究结果证实，土壤微生物与土壤代谢之间密切关系，这一发现可能有助于指导施肥管理以达到可持续提高土壤质量和作物产量的目的。

  磷的局部施肥在实现作物高产和提高养分利用效率方面具有潜在的益处，但土壤微生物与相关代谢周期之间相互作用的潜在生物学机制仍有待研究。

  本研究中，我们将微生物学与非靶标代谢组学相结合，基于高通量测序和液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS），探索了磷肥浓度和施肥模式对小麦土壤微生物群落和代谢功能的影响。

  根据结果得出，磷肥降低了细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因的多样性，显著改变了土壤细菌和真菌整体群落结构和组成。磷浓度和施肥模式也干扰了土壤细菌和真菌共生网络的复杂性。

  代谢组学分析表明，磷肥显著改变了土壤代谢物，差异代谢物显著富集到包括精氨酸和脯氨酸代谢、植物激素生物合成、氨基酸、植物次生代谢物、鸟氨酸衍生生物碱等在内的7个主要代谢途径。

  我们的结果表明，局部适当的磷肥在调节土壤微生物代谢中起着及其重要的作用，它们在土壤中的相互作用为理解磷管理实践的改变怎么样影响复杂的生物过程和植物对环境的适应能力提供了有价值的信息。

  译名：微生物学和代谢组学综合分析揭示了半干旱农场土壤微生物和代谢功能对磷肥的响应

  经过质控过滤后，我们分别从16S rRNA和ITS基因测序中获得1,473,243和2,486,782个有效标签。在97%分类水平上进行OTU聚类后，共获得了2,935个细菌OTUs和823个真菌OTUs。

  稀疏分析显示，细菌16S基因在1,473,243深度下趋于平缓（图S1a），而线的测序深度下趋于平缓（图S1b）。

  在微生物群落的多样性和丰富度方面，与对照相比，除120 kg P ha-1均匀施肥外，所有磷肥处理均增加了表层土16S rRNA样品中所观察到的OTUs数和Chao1指数；除60 kg P ha-1条带施肥（小麦种子5 cm下施肥）外，所有磷肥处理均明显降低了下层土壤的OTUs数和Chao1指数。

  在表层土壤中，仅120 kg P ha-1条带施肥处理下土壤的Shannon指数高于对照土壤，所有施肥处理均降低了下层土壤的Shannon指数。

  在表层土壤中，只有60 kg P ha-1的条带施肥明显地增加了OTUs的数量以及真菌的多样性和丰富度（如Shannon和Chao1指数）；在下层土壤中，与对照组相比，所有磷肥处理均降低了多样性和丰富度指数。

  简而言之，施磷浓度和不同的施磷模式会改变土壤微生物群落的多样性和丰富度指标。

  基于PCA分析，我们评价了5个处理间微生物群落的变化（图S2）。细菌和真菌群落的前两个主成分解释了基于OTU水平的总变异度（图S2a和b）。

  这些地块揭示了5个处理下表层土壤和下层土壤中细菌和真菌群落的明显差异。其中每个处理的3个重复通常聚集在一起，并与其他处理分离。

  沿PC1和PC2的各处理间较大的距离表明，磷肥对细菌群落结构的影响大于磷肥对真菌群落结构的影响。 细菌序列分布于43个细菌门，209个细菌科以及471个细菌属。

  在上述细菌门中，施肥处理明显地增加了表层土壤中绿弯菌门和奇古菌门的相对丰度，降低了变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度（图1b）。

  在下层土壤中，所有磷肥处理均降低了变形菌门、奇古菌门和拟杆菌门的相对丰度，但增加了放线菌门、绿曲菌门和厚壁菌门的相对丰度。

  在表层土壤中，所有磷肥处理均增加了节杆菌、Gaiella和芽球菌属的相对丰度。这三种细菌在60和120 kg P ha-1的条带施肥处理中丰度最高，而磷肥降低了芽孢杆菌和Dongia的丰度。

  在下层土壤中，施加磷肥增加了节杆菌属、芽球菌属、Skermanella和芽孢杆菌属的丰度，但降低了鞘氨醇单胞菌属和溶杆菌属的丰度。

  除了在门和属水平上存在的差异外，各种处理增加了不同细菌分类群的丰度（图S3）。

  以log10LDA评分 4.0为标准，我们在门、科、纲、目、属或种水平上，在不同处理的上层土壤和下层土壤中分别鉴定出12个和4个生物标志物，它们代表了所有处理中表层土和下层土之间的差异物种（图S3）。

  图1 磷施肥后主要细菌门（a）、细菌属（b）、真菌门（c）以及真菌属（d）的相对丰度。

  在表层土壤的门水平上，与对照相比，所有磷肥处理均提高了子囊菌门、毛霉菌门、球囊菌门和油壶菌门的丰度。

  但磷肥处理降低了担子菌门和壶菌门的丰度（图1c）。在下层土壤中，所有磷肥处理均增加了子囊菌门和油壶菌门的相对丰度，而降低了芽枝霉门的相对丰度（图1c）。

  在表层土壤中，所有磷肥处理均明显提高了附球菌属和Cladosporium的相对丰度，但仅降低了丝核菌属的相对丰度。

  在下层土壤中，磷肥施加提高了Cladosporium、链格孢属和丝核菌属的相对丰度，但降低了附球菌属、Botrytis、Solicoccozyma以及丝核菌属的相对丰度。

  以 log 10 LDA评分 4.0为标准，我们在门、科、纲、目、属或种水平上，在不同处理的上层土壤和下层土壤中分别鉴定出8个和20个生物标志物，这些生物标志物代表了表层土和下层土之间的差异物种（图S4）。

  在不同施肥处理条件下，在表层土壤或下层土壤样本中，基于磷贫瘠组和磷充足组之间的显著相关性（Spearman相关性，P 0.05）对土壤微生物网络进行构建。

  对于条带施肥处理而言，磷贫瘠组的表层土壤和磷充足组的表层土壤的细菌网络分别由86个和87个节点以及200条和250条链接构成（图2a和b）。

  对于均匀施肥而言，其土壤微生物网络分别由85个节点（磷贫瘠）和80个节点（磷充足）以及384个链接（磷贫瘠）和255个链接（磷充足）构成（图2c和d）。

  在条带施肥（a-b）或是均匀施肥（c-d）处理中，在磷充足（a，c）或磷贫瘠（b，d）条件下，基于16S rRNA基因测序所构建的表层土壤（0-20 cm）微生物之间的连通性。

  节点（彩色点）代表网络中涉及的属，链接代表节点之间的关系。红线代表显著正相关关系（Spearman相关性，r 0.7，P 0.05），蓝线表示负相关关系（Spearman相关性，r - 0.7，P 0.05）。

  对于条带施肥处理下，在表层土壤样本中，基于ITS基因所构建的线个链接（磷充足）（图3a和b）。对于均匀磷施肥处理，其线个链接（磷充足）（图3c和d）。

  细菌网络和线所示。在条带施肥后的表层土壤中，磷充足组的细菌群落平均聚类系数和程度值高于磷贫瘠组。

  在均匀磷施肥的情况下，磷充分组的所有这些属性均低于磷贫瘠组。在下层土壤的细菌网络方面，相比于磷贫瘠组而言，磷充足组经条带施肥后提高了平均聚类程度；而均匀施用磷肥后，磷充足组的所有这些性质均低于磷贫瘠组。在真菌网络性质方面，条带施肥处理后，磷充足组的真菌群落平均聚类程度和平均最短距离要高于磷贫瘠组。

  均匀施肥处理后，磷充足组增加了真菌群落平均聚类程度和平均聚类系数，但降低了平均最短距离。

  对下层土壤的真菌网络而言，无论何种施肥方式，磷充足组的群落平均聚类程度均高于磷贫瘠组，但其他拓扑性质则要低于磷贫瘠组。

  此外，细菌网络（图2和图S5）和线）的核心分类群（属水平上）上具有非常明显差异，例如在不同处理之间（磷充足与否）或是不同施肥方式之间（条带或是均匀施肥）都表现出显著性差异。

  在条带施肥（a-b）或是均匀施肥（c-d）处理中，在磷充足（a，c）或磷贫瘠（b，d）条件下，基于ITS基因测序所构建的表层土壤（0-20 cm）微生物之间的连通性。 节点（彩色点）代表网络中涉及的属，链接代表节点之间的关系。

  磷肥处理下小麦土壤代谢水平上的差异 为确定土壤代谢活动对磷肥暴露的响应，基于UPLC-MS/MS，我们对30份土壤样品的代谢组学进行了分析。

  经质控过滤后，基于主成分分析（PCA分析），我们对所有处理样本之间的差异情况做了分析（图4a）。

  我们从30份土壤样品检测到582种已知代谢产物，这些代谢物包括脂质和类脂质分子（14.1%）、有机杂环化合物（6.2%）、有机酸和衍生物（6.0%）、苯丙素和聚酮（4.8%）、苯类（3.1%）、有机氧化合物（2.4%）、核苷、核苷酸和类似物（1.7%）、有机氮化合物（1.0%）、生物碱及衍生物（0.9%）、木脂素类，新木脂素类及相关化合物（0.2%）、有机物（0.2%）、有机氧化合物（0.2%），以及一些未分类的代谢产物。

  基于监督判别分析统计方法PLS-DA模型，我们对对照组组内和处理组内以及对照组和处理组组间的差异进行了分析，以探究磷浓度和施磷模式对土壤代谢物的影响情况。

  基于PLS-DA（图4b），我们得知，所有处理的代谢产物组成相似，但在条带施肥60 kg p ha-1和条带施肥对照组之间有差异。

  PLS-DA模型表明该模型良好，可用于筛选其他处理组和对照组之间有差异代谢物（R2Y = 0.95，Q2Y = 0.88）（图4c）。此外我们基于火山图对差异代谢物进行筛选（图4d）。

  （a）代表表层土壤（0-20 cm）代谢物的主成分分析（PCA）；（b）代表TT60和TP0之间代谢物的PLS-DA分析；（c）代表PLS-DA的交叉验证模型；（d）以火山图的形式表示了上调以及下调的差异代谢物，其中绿点代表下调代谢物，红点代表上调代谢物，灰点代表无差异代谢物。

  基于对代谢物进行评价，我们得知不同磷肥处理对土壤代谢的影响不同。KEGG通路的富集分析表明，所有差异代谢物均富集于烟酸和烟酰胺代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、药物代谢-细胞色素P450、植物激素的生物合成、氨基酸、植物次生代谢产物以及来源于鸟氨酸、赖氨酸和烟酸的生物碱等通路。

  这些发现表明，磷肥明显影响了代谢物的合成，及相应的代谢途径（图S8）。

  为了进一步探索磷肥对小麦土壤代谢的影响，我们通过检索KEGG通路数据库，生成了涉及14个差异代谢物的代谢通路（图5c）。

  这些代谢产物参与糖、氨基酸、细胞色素P450、植物次生代谢的生物合成和植物激素的生物合成等。60 kg P ha-1施肥后，代谢产物胡芦巴碱、磷酸肌酸、莽草酸、L-谷氨酸和皂素的含量达到最大值，除L-谷氨酸外，其余代谢物均在各磷肥处理间存在非常明显差异。60 kg P ha-1施肥后，、6-羟基烟酸和胡椒碱的含量最低，其浓度甚至低于对照组。

  所有磷肥处理均明显提高了去甲的浓度，其浓度在60 kg P ha-1条形施肥（对照值的2.74倍）和120 kg P ha-1均匀施肥（对照值的3.79倍）时达到最大值。

  各处理之间就吲哚-3-乙酸而言具有差异性显著，仅在120 kg P ha-1条带施肥处理下，土壤样本的吲哚-3-乙酸浓度明显高于对照组。

  胡椒碱浓度除120 kg P ha-1施肥处理提高了胡椒碱浓度外，其余处理均未对其浓度造成显著的影响。相较于其他处理组而言，60 kg P ha-1条带施肥明显提高了N-乙酰鸟氨酸浓度（图5b和c）。

  （a）代表14种差异代谢物（DMs）的结构式；（b）代表不同处理间14种DMs的含量变化；（c）代表不同磷浓度和施磷模式下小麦土壤中差异标记代谢物的代谢途径图谱。

  5 土壤化学性质与微生物之间的关系 为了优化磷肥的施用以达到最好的促植物生长作用，我们进一步探究了微生物与其代谢产物之间的关系。

  因此，我们分析了微生物和那些在不同处理组之间具有非常明显差异的代谢物之间的相关性关系。

  通过分析，我们观察到相对丰度排名前10的细菌（图6a）和相对丰度排名前10的线b）分别与差异代谢物之间表现出显著（P 0.05）和极显著（P 0.01）的关系。

  真菌和代谢物之间的关系如图6b所示，相较于细菌与代谢物之间表现出相关性的数量关系，真菌与代谢物之间表现出相关性的数量较少。

  只有代谢产物胡芦巴碱、磷酸肌酸、去甲、、吲哚-3-乙酸、L-异亮氨酸和N-乙酰鸟氨酸与真菌之间表现出显著相关的关系。

  这些根据结果得出，6个细菌属（节杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、未鉴定的酸杆菌属、芽球菌属、Gailla和Skermanella）的相对丰度，4个真菌属（附球菌属、被孢霉菌属、Pseudombrophila和Solicoccozyma）与某些代谢产物的相关性最强，这表明这些微生物可能参与了土壤中大多数代谢产物的形成。

  垂直轴代表细菌（基于16S rRNA基因序列）和真菌（基于ITS基因序列）的差异属。横轴代表不同的代谢物。

  红色和蓝色分别表示正相关和负相关，*和**分别表示具有非常明显性关系（P 0.05）和极显著性关系（P 0.01）。

  基于高通量测序以及液相色谱串联质谱的方法，本研究探究了不同磷肥处理对小麦土壤细菌和真菌群落以及代谢组学的影响。

  不同的磷浓度以及不同磷施用模式改变了土壤细菌和真菌的多样性、丰度、群落组成和微生物代谢产物含量。复杂微生物群落中的土壤微生物参与土壤养分循环的调节，影响土壤性质、植物生长以及生态系统可持续发展。

  土壤微生物在植物的磷循环和磷的有效性中起着关键作用。微生物群落受到肥料和其他影响植物根系生长的农业干预措施的影响。在草地上添加磷肥显著影响细菌和真菌群落。

  本研究发现，磷肥对小麦土壤微生物的影响与对其他植物土壤微生物的影响不同。这反映了植物物种怎么样影响真菌和细菌对磷施用的响应。 细菌是土壤微生物中种类最丰富且最为多样的微生物。

  它们通过参与土壤养分循环、维持土壤结构和促进植物生长，在农业ECO中发挥重要作用。

  本研究根据结果得出，磷肥施加改变了小麦土壤细菌群落的组成，例如，我们观察到磷肥的施加增加了所检测到的OTU数量，但对多样性没有显著影响（表1）。

  这与之前的研究结果相一致。先前的研究曾发现，磷肥的施用能够影响土壤细菌群落组成，本研究也发现了类似的结果（图1，图S3）。

  事实上，磷营养状况和磷循环可能与土壤中细菌群落组成有关。与此观点一致，我们的根据结果得出，磷浓度和磷肥施用模式改变了细菌群落组成。

  例如，磷肥提高了绿弯菌门和奇古菌门的相对丰度，但降低了拟杆菌门的丰度，这可能是由于根际拟杆菌门净生长环境条件的改变，或是其他微生物竞争的减少所导致。

  Haichar等人曾发现，拟杆菌门能同化小麦、玉米、油菜和桶状三叶草等4种植物的根系分泌物。

  一些研究人员发现，磷肥提高了拟杆菌门的相对丰度，并可能与不同的土壤性质、施肥量和管理方法有关。

  这些变化可能会影响植物和土壤中的磷代谢。 表1 基于16S rRNA基因和ITS基因测序获得的细菌和真菌群落多样性分析。

  虽然，植物根系分泌物也具有一些土壤酶活性（如磷酸酶和植酸酶），但土壤中大多数的有机磷被土壤微生物水解。

  本研究结果与先前分析20年磷施肥影响的研究结果一致。但本结果与高强度磷肥对真菌多样性无显著影响的研究结果相反。

  就他们的研究而言，土壤微生物可释放多种土壤酶用以合成腐殖质、矿化降解有机质、促进或抑制植物生长以及参与循环养分。 共生网络是微生物群落稳定响应外界干扰的主要的因素。网络分析可用于确定一些微生物物种在特定生态环境中如何相互作用，并确定影响群落的关键物种。研究表明，环境变化、农业管理或添加外源有机质都会改变土壤微生物网络的复杂性。

  例如，葡萄糖的添加增加了包含phoD的细菌网络的复杂性，并降低了真菌网络的复杂性。

  我们的研究同样表明，磷浓度和施磷模式会对微生物网络的复杂性和稳定能力造成影响（图2和图3）。

  关键分类群在微生物群落中发挥着独特且关键的作用，它们的变化将改变整个微生物网络的结构和功能。我们的研究发现，不同的磷浓度和施磷模式改变了微生物群落的结构。

  此外，关键微生物类群随着微生物群落组成的变化而变化，也改变了网络结构和功能。 土壤代谢产物大多数来源于植物根系和微生物。根分泌物的组成基于植物种类、基因型以及环境胁迫的不同而具有差异。

  土壤代谢物组成和含量的变化可以揭示土壤微生物对土壤养分的直接响应，或是对曾经土壤养分的改变做出回应。

  我们的研究发现，磷水平和模式明显影响包括有机酸和衍生物、有机氧化合物、脂质和脂质样分子、生物碱和衍生物在内的土壤代谢物谱。随后干扰一些代谢途径，诸如涉及碱性碳、磷和脂质代谢的途径。

  此外，参与这些代谢途径的代谢产物也发生了明显的变化，例如，磷参与了高能磷化合物--磷酸肌酸的合成。

  当其水解时，磷酸肌酸能释放大量能量，调节糖酵解酶的活性，加速代谢活性。

  我们的根据结果得出，磷肥促进了该化合物的合成，从而加速了土壤中的代谢。与这一结果相一致的是，我们得知施加磷肥后增加了胡芦巴碱的浓度，一种可从豆科植物中提取到的营养添加剂。

  糖酵解能够合成莽草酸，进而参与植物生长发育，同时也是合成苯丙氨酸和酪氨酸的前体。

  同样，磷肥增加了L-谷氨酸和N-乙酰胆碱的合成，L-谷氨酸和N-乙酰胆碱不仅是谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸以及赖氨酸的合成前体，同时还参与尿素循环。

  本研究中，磷肥增加了土壤中6-羟基烟酸和胡椒碱的水平，6-羟基烟酸和胡椒碱作为植物杀虫剂的产生中间产物，其浓度的增加可能会增加植物对害虫的抗性。吲哚-3-乙酸是一种典型的生长素，能调节植物的生长。L-异亮氨酸作为一种氨基酸，其能够最终靠糖代谢、氨基酸代谢和微生物发酵合成。

  磷肥还增加了皂素含量。一种广泛存在于植物中，用于合成糖苷等次生代谢产物的物质。

  所有这些结果都证明磷肥可促进植物和微生物代谢。顺式-4-羟基-D-脯氨酸作为一种渗透调节剂，其作为一种稳定的生物大分子，能够降低细胞酸度，调节细胞氧化还原电位，其浓度的增加，可能促进植物的抗逆性。

  土壤微生物是土壤代谢活动的重要执行者，土壤代谢组学作为一项新的技术，其可直接反映土壤微生物在各种条件下的生物学响应。

  更重要的是，微生物种类和丰度的变化在某些特定的程度上决定了土壤代谢产物种类和丰度的变化，进而决定了外源养分在土壤中的循环与代谢。

  因此，揭示土壤代谢与细菌群落的相关性具备极其重大意义。Song等人的研究表明淀粉和蔗糖代谢功能与不同代谢途径中的不同细菌组分有极强的相关性。

  这可能证实了不同的细菌组分在根际对淀粉和蔗糖代谢功能的调节中导致不同的代谢结果。此外，该研究结果还证实，不同的细菌成员通过调节土壤中淀粉和蔗糖的代谢功能和柠檬酸循环导致不同的代谢产物产生。以往的研究发现代谢产物与内生真菌之间有明显的相关性。我们的研究根据结果得出，施肥诱导的几种代谢产物的改变与细菌和真菌群落的变化有关。这也支持了土壤微生物能够在一定程度上促进或抑制土壤代谢产物积累的观点。

  土壤代谢产物与微生物群落的关系将指导植物通过土壤改良或生物技术调控植物根系过程，来提升植物产量。有必要注意一下的是，代谢组学分析是在特定条件下，在特定时间对生物代谢物进行分析。

  但土壤代谢物谱的动态变化及其与土壤微生物群落结构的相关性有待进一步研究。 虽然，根据结果得出磷肥能够对小麦土壤微生物和代谢造成影响，但相关研究仅处于初步阶段，仍存在缺陷。

  许多研究认为，土壤性质是驱动微生物群落结构的外因，如pH、总N、总碳、总磷、有机质等。此外，在土壤中，各种真菌和细菌一同生活，共同形成复杂的物种相互作用系统。

  因此，了解细菌和真菌如何共存和相互作用具十分重要的意义。虽然结果证实了细菌和真菌之间的共生关系，以及不同真菌之间的共生关系，但细菌和真菌之间的共生尚未被揭示。更重要的是，我们目前的研究对象仅为土壤。

  如果我们将其与植物结合，能更好地揭示磷肥的影响机制，这方面仍需进一步进行研究。

  本研究基于新一代测序技术和液相色谱串联质谱的方法，揭示了磷肥与土壤微生物群落组成和代谢的相关性，同时探究了不同磷浓度和不同施磷模式对小麦土壤细菌和真菌群落以及代谢组学的变化

  基于Shannon指数，与对照相比，磷肥降低了细菌多样性（除120 kg P ha-1条带施用的表层土壤样本外）。

  在真菌多样性方面我们也观察到了相似的结果（除60 kg P ha-1均匀施用的在表层土壤样本外）。

  此外，磷浓度以及施磷模式都显著改变了细菌和真菌群落结构和组成，干扰了细菌和真菌群落的共生网络以及决定网络稳定性的关键分类群。

  代谢组学根据结果得出，磷浓度和施磷模式也显著改变了土壤代谢物组成，干扰了受磷肥处理后明显提高的差异代谢物参与的代谢途径，这些变化与某些微生物类群的变化显著相关。

  本研究结果证实，土壤微生物与土壤代谢之间密切关系，这一发现可能有助于指导施肥管理以达到可持续提高土壤质量和作物产量的目的。